对生猪养殖业而言，非洲猪瘟是目今最具危险性的熏染疾病之一自2018年冬季传入我国以来以对我国生猪养殖业带来了重大损失 。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种高度接触性，致死率极高的烈性熏染病 。由于非洲猪瘟临床症状与猪瘟（CSF）和猪滋生与呼吸障碍综合征（PRRS）等病症极其相似，以是仅通过临床症状无法区分，因此需要使用分子生物学手段对非洲猪瘟病毒举行检测，以做到对非洲猪瘟病毒实时、快速、准确的诊断，以确保将非洲猪瘟的威胁性降到最低 。笔者将简述现在常见的非洲猪瘟病毒检测要领及注重事项，以期为生猪养殖从业职员在非洲猪瘟病毒检测及非瘟防控提供参考 。
1 非洲猪瘟病毒检测要领
1.1 病原学检测
ASFV的病原学检测，主要有聚合酶链式反应（PCR）、微滴数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）、线性指数PCR、重组酶聚合酶扩增手艺（RPA）、原位杂交手艺（ISH）、环介导恒温扩增手艺（LAMP）、探针杂交手艺等 。
PCR检测：PCR是疫病最早期接纳的检测要领，非洲猪瘟病毒的PCR检测是凭证其基因中的高度守旧区序列，设计特异性引物举行扩增，检测和判断属于所有已知病毒基因型的普遍疏散株 。依据天下动物卫生组织推荐的的PCR检测要领，可以扩增出22株差别的ASFV病毒，但古板PCR要领由于耗时较长且对装备要求高，因此并未普遍应用于养殖一线 。
巢式PCR：采用内外两对PCR引物，可以在检测组织、血液样品和作育物的基础上，检测昆虫体内所带的ASFV 。巢式PCR战胜了单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；并且由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应一连放大举行的可能性，包管了反应的特异性；由于内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产品，第二阶段反应能否举行，也是对第一阶段反应准确性的判断，因引此可以包管整个反应的准确性及可行性 。
荧光定量PCR：荧光定量PCR是在通例PCR基础上对某些特定基因如p72、p54、K205R等设计引物和探针，使得检测特异性和敏感性获得了较大的提升 。非洲猪瘟传入中国以来，由于部分猪场已经泛起CSFV、ASFV以及PRRSV混淆熏染的情形 。因此，使用多重PCR手艺不但可对混淆熏染的猪只做实时和准确的诊断，并且还能极洪流平镌汰检测耗材的使用，缩短检测时间 。
微滴数字PCR检测：ddPCR比通俗荧光定量具有更高的敏感性和特异性，其接纳终点稀释要领实现了最小剂量单分子病毒的扩增，进而盘算出样品的起始浓度，最终抵达对病毒含量的绝对定量 。但由于微滴数字PCR需要使用较为腾贵的仪器装备和试剂，因此很难用于大规容貌品的检测 。
环介导等温扩增手艺：是一种“轻盈、快速、准确、低价”的基因扩增手艺，可做到快速检测非洲猪瘟病毒，通常30分钟即可完成检测 。与通例PCR相比，环介导等温扩增不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外视察等历程，因此对仪器装备的要求较低，便于在养殖场、屠宰场、饲料厂举行快速检测，该检测要领也是现在生产一线最常用的非洲猪瘟病毒检测要领之一 。
重组聚合酶扩增手艺：重组聚合酶扩增手艺是一种新兴的分子学检测要领，现在也被应用于ASFV的检测中，其原理类似于体内的DNA的复制历程，通过天生重组酶-DNA复合物来启动DNA的合成，进而举行目的区域的指数式扩增 。由于RPA的反应温度介于37-42℃之间，舍去了通例实时荧光定量手艺中加热到退火的历程，以是其反应时间可以缩短至20分钟左右 。该要领在包管了扩增敏感性和特异性的同时，又极大的缩短了检测时间 。
下图为实时荧光定量手艺检测非洲猪瘟病毒的基来源理（图1） 。
图 1实时荧光定量手艺原理
1.2 血清学检测
使用抗原抗体反应举行的抗原检测和抗体检测，是血清学检测的两种主要手段 。针对ASFV抗原的检测要领主要有荧光抗体试验、双抗夹心酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析法等；针对ASFV抗体的检测要领主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光试验、胶体金免疫层析手艺等 。
血清学抗原检测：现在天下动物卫生组织推荐的用于抗原判断的要领为荧光抗体试验，主要用于判断不爆发红细胞吸附试验反应的非洲猪瘟病毒毒株，通过荧光标记单抗而检测动物组织内的抗原；在ELISA基础上生长起来的双抗夹心ELISA要领，运用抗原抗体特异性团结原理，先将特异性抗体与固相载体团结，在此基础上加入待检抗原，然后加入酶标抗体，使得一单位的抗原同时团结两个单位的抗体从而形成所谓的“双抗体夹心”，最后加入底物试剂与酶标抗体团结，凭证显色深浅来判断抗原含量 。别的，ASFV的交织引物扩增团结免疫层析快速检测要领，不但利便快捷，且有着优异的敏感性 。免疫胶体金手艺是一种常用的标记手艺，而胶体金免疫层析规则是运用类似于侧向流动免疫色谱剖析的虹吸原理，来检测样品中抗原的有无，适合快速检测和盛行病学视察 。
血清学抗体检测：抗体检测是血清学检测中最通例的要领，现在针对p72、p30、p54、K205R等ASFV卵白，海内外都已建设了间接ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA等多种要领 。现在市场上已有许多商品化ELISA试剂盒，特异性与迅速度都很是高，是人们举行ASFV检测时的首选要领 。同时，免疫胶体金手艺针对包被分子的差别也可以用来检测ASFV抗体，该两种要领均是生产一线中快速诊断非洲猪瘟的要领之一 。
2 非洲猪瘟病毒检测注重事项
非洲猪瘟病毒检测涉及样本收罗、样本生涯、样本运输、样本处置惩罚与最终检测等多个环节，一个环节泛起纰漏，就极易泛起假阳性或者假阴性的过失检测效果 。提高检测可靠性，阻止泛起假阳性或者假阴性效果，我们需要做到以下几点 。
2.1 样品端
规范样本收罗操作 。随机采样时要注重仔细视察猪的精神状态，对精神状态欠好伴有发热症状的猪只要重点收罗确保不漏任何一头；或者随机采样时，对全群猪只举行距离收罗，包管不漏采任何一头疑似猪只 。当收罗的样品为组织样时，应将样品50%中性甘油溶液或含I00 μg/mL青霉素和链霉素的PBS溶液中，样品收罗完成后要置于低温情形中生涯和运输（12h内可4℃情形中运输），抵达实验室至检测前应将样品置于－20℃中生涯，以包管检测效果的准确性 。
2.2 试剂端
规范化检测试剂的生涯 。很大一部分假阳性与假阴性的检测效果，是由于检测试剂生涯不当造成的 。因此我们要规范化检测试剂的管理，做好试剂的生产日期及失效日期挂号，并将试剂生涯在相宜的情形中 。
2.3 病毒检测端
病毒检测历程中若存在不切合操作规程的地方也会导致检测效果蜕化 。核酸检测是微量操作，要求极为严酷 。首先，要做好检测职员的专业知识和实操手艺的培训，包管检测职员在样品处置惩罚端和加样端的操作切合规程 。另外样品RNA提取和逆转录的历程对操作职员的加样速率、超纯水以及清洁度要求较高，若是情形中保存RNA酶则会使RNA降解从而导致检测效果蜕化 。因此，在病毒检测端在包管操作情形清洁的同时一定要确保检测职员有着较高的实验室素养和实操水平 。
3 总结
虽然分子生物学检测非洲猪瘟病毒是诊断非洲猪瘟疾病最有用的、最便捷、最准确的要领，可是要确保检测效果的真实可靠就一定要将病毒检测历程中每一个操作办法都执行到位，准确可靠的效果能有用避免非洲猪瘟的进一步扩散，降低非洲猪瘟对生猪养殖业的威胁 。
